高通量测序

一、实验流程

16S/18S/ITS rDNA，序列包括保守区域和高变区域，其中保守区在微生物菌种间差异不

大，高变区具有属或种的特异性，随亲缘关系不同而有一定的差异。因此，16S/18S/ITS

rDNA 可以做作为揭示生物物种的特征核酸序列，被认为是适于微生物系统发育和分类鉴定

的指标。如今，16S/18S/ITS rDNA 扩增子测序技术已成为研究环境样本中微生物群落组成

结构的重要手段。

16S rDNA 扩增子测序，是通过特异性引物扩增样本中原核生物16S rDNA 的可变区，

构建高通量测序文库并对16S rDNA 可变区序列进行分析，从而鉴定环境中原核微生物的组

成与丰度的方法。GENEWIZ 自主研发的引物体系能有效扩增出16S rDNA 的多个可变区（V3，

V4），能够准确鉴定出包含古生菌在内的多个物种。18S/ITS rDNA 扩增子测序，是通过特

异性引物扩增样本中真核生物18S/ITS rDNA 的可变区，构建高通量测序文库并对18S/ITS

rDNA 可变区序列进行分析，从而鉴定环境中真核微生物的组成与丰度的方法。Illumina

MiSeq 测序平台由于在测序深度、通量、运行周期、测序准确性及价格方面的优势，广泛应

用于16S/18S/ITS rDNA 扩增子测序；近年来，Paired-end Reads 拼接方法使MiSeq 测序平台

的读长达到了600bp，从而使分析准确性得到进一步提高。

16S/18S/ITS rDNA 扩增子测序的实验流程包括样本基因组DNA 的提取与质检，

16S/18S/ITS rDNA 可变区扩增与测序文库构建，高通量测序等多个步骤。其中每一个环节

都会对数据质量和数量产生影响，而数据质量又会直接影响后续信息分析的结果，为了保证

源头数据的准确性与可靠性，我们对每一步实验过程都进行严格质控，检测合格后，按照目

标数据量调整文库体积，将多个文库混合后进行Illumina MiSeq 测序。具体实验流程如下：

Figure 一.1 菌群多样性测序实验流程

二、生物信息分析流程

首先对原始数据进行去接头和低质量过滤处理，然后去除嵌合体序列，得到有效序列后

进行聚类分析，每一个聚类称为一个物种操作单元（Operational Taxonomic Units，OTU）， 对

OTU 的代表序列作分类学分析，得到各样本的物种分布信息。基于OTU 分析结果，可以对

各个样本进行多种α多样性指数分析，得到各样本物种丰富度和均匀度信息等；基于分类学

信息，可以在各个分类水平上进行群落结构的统计分析；通过计算Unifrac 距离、构建UPGMA

样本聚类树、绘制PCoA 等图，可以直观展示不同样本或分组之间群落结构差异。

在上述分析的基础上，还可以进行一系列深入挖掘，如通过多种统计分析方法分析分组

样本间的群落结构差异性，结合环境因子和物种多样性关联分析，挖掘显著影响组间群落结

构变化的环境影响因子等。

二、生物信息分析流程

首先对原始数据进行去接头和低质量过滤处理，然后去除嵌合体序列，得到有效序列后

进行聚类分析，每一个聚类称为一个物种操作单元（Operational Taxonomic Units，OTU）， 对

OTU 的代表序列作分类学分析，得到各样本的物种分布信息。基于OTU 分析结果，可以对

各个样本进行多种α多样性指数分析，得到各样本物种丰富度和均匀度信息等；基于分类学

信息，可以在各个分类水平上进行群落结构的统计分析；通过计算Unifrac 距离、构建UPGMA

样本聚类树、绘制PCoA 等图，可以直观展示不同样本或分组之间群落结构差异。

在上述分析的基础上，还可以进行一系列深入挖掘，如通过多种统计分析方法分析分组

样本间的群落结构差异性，结合环境因子和物种多样性关联分析，挖掘显著影响组间群落结

构变化的环境影响因子等。